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2022-10-27 10:38:18 By : Mr. Gary Tong

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heterologe MbxA-Substrat durch Acylierung und sekretiert den Vorläufer proMbxA und aktives MbxA, was die Reinigung beider Spezies in ausreichenden Mengen für eine Vielzahl von Untersuchungen ermöglicht.Die aktivierende E. coli-Acyltransferase HlyC erkennt die Acylierungsstellen in MbxA, aber unerwarteterweise in einem anderen Acylierungsmuster als für ihr endogenes Substrat HlyA.HlyC-aktiviertes MbxA zeigt Wirtsspezies-unabhängige Aktivität, einschließlich einer bisher unbekannten Toxizität gegenüber menschlichen Lymphozyten und Epithelzellen.Mittels Live-Cell-Imaging zeigen wir eine sofortige MbxA-vermittelte Permeabilisierung und eine sich schnell entwickelnde Blasenbildung der Plasmamembran in Epithelzellen, die mit einem sofortigen Zelltod einhergeht.Angesichts einer zunehmenden Häufigkeit von Antibiotikaresistenzen bei humanpathogenen Bakterien ist die Charakterisierung von Virulenzfaktoren, ihrer posttranslationalen Modifikationen und ihrer Sekretionsmechanismen Schlüsselfaktoren für die Entwicklung neuartiger Antivirulenzstrategien gegen bakterielle Infektionen.Das Targeting beispielsweise von bakteriellen Toxinen ist ein vielversprechender Ansatz für zukünftige Therapeutika, die auf spezifische Krankheitserreger und Pathogenitätsfaktoren zugeschnitten werden müssen1,2.Proteine ​​der Repeats in Toxins (RTX)-Familie werden von vielen Gram-negativen Bakterien, die Typ-1-Sekretionssysteme (T1SS) verwenden, in den extrazellulären Raum sezerniert.Die wachsende Zahl sequenzierter Bakteriengenome enthüllte neue Mitglieder dieser RTX-Familie3.Viele RTX-Proteine ​​sind Virulenzfaktoren wichtiger Krankheitserreger wie der Toxine CyaA aus Bordetella pertussis oder Hämolysin A (HlyA) aus uropathogenen E. coli (UPEC).RTX-Proteine ​​sind durch Glycin-reiche Nonapeptid-Wiederholungen mit der Consensus-Sequenz GGxGxDxU (x – beliebige Aminosäure, U – große hydrophobe Aminosäure) gekennzeichnet, die die sogenannten GG-Wiederholungen darstellen3,4.Wiederholungen dieser Wiederholung in der Nähe des C-Terminus bilden die RTX-Domäne5, während die Variabilität des N-Terminus zwischen verschiedenen RTX-Proteinen verschiedene Funktionen ermöglicht (für eine Übersicht siehe3).Eines der am besten charakterisierten T1SS ist das HlyA-Sekretionssystem von E. coli, das aus dem ABC-Transporter Hämolysin B (HlyB), dem Membranfusionsprotein Hämolysin D (HlyD) und dem Außenmembranprotein TolC6,7,8 besteht.Hier vermittelt die C-terminale, nicht spaltbare Sekretionssequenz von 50–60 Aminosäuren von HlyA (Abb. 1) eine spezifische Wechselwirkung mit den inneren Membrankomponenten HlyB und HlyD dieses T1SS9,10,11,12.Vor und während des Transports, der in einem einstufigen Mechanismus durch beide Membranen des Gram-negativen Bakteriums erfolgt9,11,12, bleibt HlyA ungefaltet und erreicht seine native Konformation erst bei Sekretion in die extrazelluläre Flüssigkeit, wo Ca2+-Ionen gebunden werden die RTX-Domäne induziert die Faltung des Proteins5,13,14,15.Schematische Darstellung der Primärstruktur von MbxA und HlyA.In MbxA sind fünf konservierte GG-Wiederholungen mit der Konsensussequenz GGxGxDxUx vorhanden, während HlyA sechs konservierte GG-Wiederholungen trägt (gelbe Kästchen).Sie bilden zusammen die Ca2+-bindende RTX-Domäne.Als RTX-Protein besitzt HlyA charakteristischerweise ein C-terminales Sekretionssignal von etwa 60 Aminosäuren10,11,12, das blau dargestellt ist.Für MbxA ist die Länge der Sekretionssequenz unbekannt und nicht maßstabsgetreu gezeichnet.Im N-terminalen Teil von HlyA ist eine hydrophobe Domäne an der Porenbildung beteiligt53 und rot markiert.Abhängig vom Vorhersagealgorithmus (siehe Materialien und Methoden) für MbxA wird entweder (1) eine einzelne membranüberspannende Helix von Rest 363 bis 383 vorhergesagt, (2) ein Satz von Transmembranhelices, die eine mehrdeutige hydrophobe Domäne von Rest 210 bis 383 bilden, oder (3) sogar von Rest 120 bis 383 (gestrichelte Linien) werden vorhergesagt52.Die Position der acylierten Lysinreste K564 und K690 von HlyA und der homologen Reste, von denen bei Sequenzvergleichen vorhergesagt wurde, dass sie in MbxA, K536 und K660 acyliert werden, sind angegeben und dienten als Ankerpunkt für das Schema.HlyA gehört zu den klassischen porenbildenden RTX-Toxinen und ist gegen eine Vielzahl von Zellen aktiv, darunter Erythrozyten, Leukozyten, Epithel- und Endothelzellen verschiedener Spezies16,17,18.Für die zytotoxische Aktivität, nicht aber für die Sekretion, ist vor der Sekretion eine posttranslationale Fettsäureacylierung von zwei internen Lysinresten (Lys 564 und Lys 690), katalysiert durch die intrazelluläre Acyltransferase HlyC, erforderlich (Abb. 1)19,20.Eine solche Acylase wird auch für andere RTX-Toxine wie CyaA aus Bordetella pertussis oder LktA aus Mannheimia haemolytica benötigt und das für die Transferase kodierende Gen ist in dem für T1SS kodierenden Operon vorhanden.Die Struktur der Acylase aus Actinobacillus pleuropneumoniae21 könnte als Blaupause dienen und erste Einblicke geben, wie die Acyltransferase zwei Fettsäuren auf das RTX-Toxin überträgt, ein Prozess, für den das Acyl-Carrier-Protein (ACP) benötigt wird.Bei HlyA handelt es sich bei den übertragenen Fettsäuren überwiegend um C14 und in geringerem Maße um C15 und C1722.Am wichtigsten ist, dass beide Lysinreste unabhängig voneinander in vivo acyliert werden können, aber die Acylierung beider Lysinreste ist für die toxische Aktivität von HlyA20 unbedingt erforderlich.Die letztgenannte Beobachtung wurde kürzlich in Frage gestellt23.Obwohl der Mechanismus der Porenbildung durch RTX-Toxine jahrzehntelang untersucht wurde, bleibt er schwer fassbar.Fettsäureacylierung ist für die Zelllyse erforderlich, aber die Architektur der Pore oder die genaue Anzahl der HlyA-Protomere, die die Pore bilden, ist unbekannt.Derzeit werden zwei Modelle diskutiert.Erstens eine reine proteinhaltige Pore, bei der das Porenlumen ausschließlich durch Proteinsegmente gebildet wird, und zweitens eine proteolipidische oder toroidale Pore, bei der das Porenlumen sowohl durch Lipid- als auch durch Proteinsegmente gebildet wird24.Letzteres wird durch neuere Daten gestützt, die für CyaA25 erhalten wurden, während ersteres ursprünglich durch elektrophysiologische Studien beschrieben wurde, die zeigten, dass HlyA einen wassergefüllten, kationenspezifischen Ionenkanal mit einem Durchmesser von etwa 2 nm bildet26.Neben Porenbildung4 wurden Ca2+-Oszillationen bei sublytischen Konzentrationen des Toxins27, Inflammasomaktivierung28 und Zelltod aufgrund apoptotischer, nekrotischer oder pyroptotischer Prozesse29,30 beschrieben.Die Natur des HlyA-Rezeptors in der Plasmamembran des Wirts wurde ebenfalls nicht vollständig geklärt.Im Prinzip könnten zwei Hauptwege existieren, die beide durch experimentelle Daten gestützt werden.Erstens eine rezeptorunabhängige Wirkungsweise.Dieser Vorschlag basiert auf Studien mit künstlichen Membranen 31,32 und der Beobachtung, dass HlyA eine nicht sättigbare Bindung an Kaninchen-Erythrozyten aufweist33.Die Identifizierung des heterodimeren Integrins LFA-1 (αLß2) als Rezeptor stellte den Ausgangspunkt eines rezeptorabhängigen Wirkmechanismus dar.Der Rezeptor wurde später auf die ß2-Untereinheit (CD18) eingegrenzt34,35.Ein ähnliches Ergebnis wurde für CyaA36,37 erhalten, das das Integrin αMß2 (CD11b/CD18) erkannte.Interessanterweise trat eine Bindung an N-verknüpfte Kohlenhydrate des Integrins auf36.Dies würde auch erklären, warum CyaA oder HlyA Erythrozyten binden können, denen LFA-1 fehlt, die aber glykosylierte Proteine ​​wie Glykophorin enthalten, von dem gezeigt wurde, dass es auch als Rezeptor für HlyA fungiert38 und wahrscheinlich ein ähnliches oder identisches Glykosylierungsmuster besitzt.Im Allgemeinen ist die Primärstruktur des Sekretionssignals unter RTX-Proteinen nicht konserviert.Dies wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass das HlyA-Sekretionssystem einige nicht-native RTX-Toxine als Substrate zu tolerieren scheint, wie zum Beispiel CyaA von Bordetella pertussis, FrpA von Neisseria meningitidis, PaxA von Pasteurella aerogenes oder LktA von Mannheimia haemolytica39,40,41, 42.Die Sekretion dieser heterologen RTX-Proteine ​​wurde jedoch nicht quantifiziert oder hinsichtlich der Mengen an sezerniertem Protein als effizient nachgewiesen.Darüber hinaus zeigten verschiedene Experimente, dass das HlyA T1SS Fusionsproteine ​​sezernieren konnte.Der Austausch der HlyA-Sekretionssequenz mit dem C-Terminus von LktA erleichtert immer noch die Sekretion von HlyA43.Gleichzeitig werden nicht verwandte, aber langsam faltende Proteine, die die HlyA-Sekretionssequenz tragen, erkannt und transportiert13.MbxA aus Moraxella bovis teilt eine Sequenzidentität von 42 % mit HlyA und ist ein Schlüsselfaktor für die Pathogenität von Moraxella bovis44,45.Dieser tierische Krankheitserreger ist die Ursache der am weitesten verbreiteten Augenerkrankung bei Rindern, der infektiösen bovinen Keratokonjunktivitis (IBK)46,47.Studien mit Überständen pathogener M. bovis-Kulturen zeigten eine Zytotoxizität gegenüber bovinen Neutrophilen, Erythrozyten und Hornhautepithelzellen, die einem möglicherweise sezernierten Zytotoxin zugeschrieben wird48,49,50,51.Ein klassisches RTX-Operon, das MbxA zusammen mit der mutmaßlichen Acyltransferase MbxC zusammen mit den Transporterkomponenten umfasst, wurde später nur in pathogenen, hämolytischen M. bovis-Stämmen, nicht aber in nicht-hämolytischen Stämmen identifiziert.Mit einer Länge von 927 Aminosäuren ist MbxA etwa 10 % kleiner als HlyA.Wie bei HlyA zeigten Sequenzabgleich und Topologievorhersagen zwei potenzielle Acylierungsstellen sowie eine mehrdeutige Membraninteraktionsdomäne am N-terminalen Teil von MbxA44,52,53, während die GG-Repeats näher am C-Terminus von MbxA lokalisiert sind gegenüber der Einstellung in HlyA.Insgesamt hat MbxA eine mutmaßliche Domänenorganisation, die typisch für porenbildende RTX-Toxine ist (Abb. 1).Eine funktionelle Charakterisierung von MbxA erfordert gereinigtes und aktives Protein.Bisher wurde MbxA für Impfzwecke nur als ausgefälltes oder teilweise solubilisiertes Protein54 oder als C-terminale Fragmente55,56 hergestellt.Hier etablierten wir ein vollständiges Ersatz-T1SS in einem E. coli-Laborstamm durch eine Kombination des UPEC HlyA T1SS mit dem heterologen Substrat MbxA, das aktives MbxA oder seinen Vorläufer proMbxA sezerniert.Das heterologe E. coli-System ermöglicht es, die Expression großer Mengen an RTX-Protein zu induzieren und mit Hilfe einer stabilen Expression des T1SS eine effiziente Sekretion zu erreichen.Die rekombinante Herstellung liefert Proteinmengen, die für eine funktionelle In-vitro-Charakterisierung ausreichen.Dieses zuverlässige und induzierbare rekombinante Proteinproduktionssystem ist unabhängig von potenziellen Umweltreizen, die für die Produktion des Toxins durch M. bovis benötigt werden, und vermeidet die Kultivierung des Pathogens insgesamt.Basierend auf diesem Ergebnis haben wir ein schnelles und effizientes Reinigungsverfahren für beide MbxA-Spezies aus dem Überstand sezernierender E. coli-Zellen entwickelt.Dieser Ansatz unterscheidet sich von der zytosolischen Produktion und Isolierung aktiver RTX-Toxine aus Einschlusskörperchen wie beispielsweise CyaA aus Bordetella pertussis57 oder LtxA aus Aggregatibacter actinomycetencomitans58.In unserem Aufbau wurde rekombinantes MbxA effizient durch HlyC aktiviert, jedoch mit einem unerwarteten Acylierungsmuster im Vergleich zu HlyA.Im Gegensatz zu der zuvor gezeigten Aktivität gegen Rinder- und Schafszellen beobachteten wir ferner, dass MbxA eine Wirtsspezies-unabhängige zytotoxische Aktivität gegen menschliche Epithelzellen und Leukozyten zeigt.Unter Verwendung von Live-Cell-Imaging zeigen wir schließlich einen schnellen und deutlichen Phänotyp mit Membranblasen in menschlichen Epithelzellen als Reaktion auf die Permeabilisierung durch MbxA.RTX-Toxin-induzierte Plasmamembranblasen wurden bisher nur für das multifunktional-autoprozessierende RTX (MARTX)-Toxin RtxA1 aus Vibrio vulnificus beschrieben59.Dieses aus ungefähr 5200 Aminosäuren zusammengesetzte Multidomänenprotein enthält sechs mutmaßliche Effektordomänen, einschließlich einer porenbildenden Domäne.Unsere Ergebnisse zeigen somit, dass die Fähigkeit von MbxA, Membranbläschen zu induzieren, in der porenbildenden Domäne dieses ´klassischen´ RTX-Toxins kodiert ist und ein allgemeines Merkmal dieser Familie membranschädigender Proteine ​​sein könnte.Es wurde gezeigt, dass das HlyA T1SS ein gewisses Maß an Promiskuität besitzt39,40,41,42.Daher argumentierten wir, dass die Produktion von MbxA möglich sein könnte, indem das UPEC-abgeleitete HlyA T1SS-Sekretionssystem in E. coli BL21(DE3) eingesetzt wird.Das mbxA-Gen, das zur Erleichterung der Reinigung einen Hexahistidin-Tag (6H-mbxA) enthält, wurde daher in den pSU2726-Vektor 60 eingeführt, was zu dem Plasmid pSU-6H-mbxA führte.Die von UPEC abgeleiteten HlyA-T1SS-Innenmembrankomponenten HlyB und HlyD wurden vom pK184-hlyBD-Vektor exprimiert, während endogenes BL21(DE3)-TolC chromosomal kodiert ist13.In einem Zwei-Plasmid-System bestehend aus pK184-hlyBD zusammen mit pSU-6H-mbxA oder pSU-hlyC/6H-mbxA konnte mbxA entweder in Gegenwart der Transporterkomponenten oder zusätzlich in Gegenwart der aktivierenden Acyltransferase HlyC exprimiert werden .E. coli BL21(DE3), die sowohl pK184-hlyBD als auch pSU-hlyC/6H-mbxA tragen, zeigten hämolytische Aktivität, wenn sie auf Schafblutagar gezüchtet wurden, während in Abwesenheit von HlyC keine Hofbildung auftrat.Kolonien, die nur pSU-hlyC/6H-mbxA enthielten, verursachten keine Hämolyse, was darauf hinweist, dass die Sekretion über das T1SS und nicht die Zelllyse nicht der Grund für die toxische Aktivität von MbxA ist.Dies weist darauf hin, dass die Sekretion von aktivem MbxA tatsächlich durch heterologes E. coli HlyBD-TolC vermittelt wurde (Fig. 2).E. coli BL21(DE3), gewachsen auf Columbia-Agar mit 5 % Schafblut, das die Plasmide pK184-hlyBD mit pSU-6H-mbxA (I), pK184-hlyBD mit pSU-hlyC/6H-mbxA (II) oder pSU-hlyC enthält /6H-mbxA allein (III).Die Halo-Bildung um Kolonien, die MbxA und HlyC zusammen mit den Transporterkomponenten HlyBD (II) exprimierten, und das Fehlen einer Hämolyse um Kolonien, die nur MbxA und HlyC (III) exprimierten, weist auf eine funktionelle Sekretion von aktivem und acyliertem MbxA hin.Somit wird funktionelles MbxA nicht ohne zusätzliche Expression des HlyBD-Sekretionssystems aus E. coli freigesetzt.Die IPTG-induzierte Expression von HlyBD nur mit MbxA oder MbxA mit HlyC in Flüssigkulturen führte zu einer Akkumulation eines etwa 100 kDa großen Proteins, proMbxA bzw. MbxA, wie durch MS-Analyse (siehe unten) verifiziert, im Medium (Abb. 3).In Abwesenheit des HlyC-Proteins waren die Sekretionsniveaus von proMbxA während 5 h der Expression höher.Während proMbxA im Überstand stabil war, neigte MbxA dazu, sich in dem auf dem Medium schwimmenden Schaum anzusammeln.Heterologe Sekretion von proMbxA und MbxA über das HlyBD-System.Die Coomassie Brilliant Blue (CBB) SDS PAGE von Kulturüberständen von E. coli BL21(DE3), die HlyBD und MbxA (proMbxA, (A)) oder HlyBD, HlyC und MbxA (MbxA, (B)) koexprimieren, zeigen eine Akkumulation von proMbxA oder MbxA während eines Expressionszeitraums von 0–5 h (angezeigt durch die Zahlen über dem Gel) nach Induktion mit IPTG.Proben des Überstands wurden ohne zusätzliche Konzentrierung durch TCA-Präzipitation auf das SDS-Gel aufgetragen.Molekulargewichtsmarker in kDa sind in den Bahnen I und II gezeigt.Ein Pfeil zeigt proMbxA und MbxA an.Aus dem E. coli BL21(DE3) pK184-hlyBD, pSU-6H-mbxA-System wurden ungefähr 6 mg/l des Vorläuferproteins proMbxA aus dem Überstand unter Verwendung von Ni2+-Affinitätschromatographie gewonnen.Eine anschließende Größenausschlusschromatographie (SEC) und SDS-PAGE-Analyse ergab, dass zwei trennbare Arten von proMbxA vorhanden waren ( 4 ).(a) SEC-Chromatographien von Proben von aktivem MbxA (gestrichelte Linie) bzw. proMbxA (durchgezogene Linie), aufgetragen auf eine Superose 6 Increase 6/30-Säule (GE Healthcare).Die Extinktion bei 280 nm des Elutionsprofils von proMbxA wurde auf der linken Y-Achse aufgetragen, das Elutionsprofil von aktivem MbxA auf der rechten Y-Achse.proMbxA eluierte in zwei getrennten Hauptpeaks, markiert mit 1 und 2 im Chromatogramm.(b) CBB-gefärbte SDS-PAGE-Gele von gepoolten Fraktionen von aktivem MbxA und proMbxA, erhalten aus IMAC-Reinigung (linkes Feld) und verwendet für SEC.Die gesamten Gele sind in Abbildung S9 gezeigt.proMbxA wurde während der SEC in zwei Spezies getrennt, Peak 1 und Peak 2, und durch SDS-PAGE (rechtes Feld) bewertet.Molekulargewichtsmarker in kDa sind in den Bahnen I und II gezeigt.Die Bestimmung des Molekulargewichts (MW) durch Mehrwinkel-Lichtstreuanalyse (MALS) bestätigte, dass der erste Peak mit einem experimentell bestimmten Molekulargewicht (MW) von 201,5 ± 1,1 kDa proMbxA-Dimeren entsprach (theoretisches MW 201,2 kDa).Der zweite Peak enthielt monomeres proMbxA, da das bestimmte MW von 93,9 ± 0,3 kDa der theoretischen Masse von 100,6 kDa entsprach (Fig. 5).Die Plasmidkombination pK184-hlyBD und pSU-hlyC/6H-mbxA ermöglichte die Isolierung von aktiviertem MbxA, das mit 6 M Harnstoff aus dem Schaum der Expressionskultur solubilisiert und anschließend in Gegenwart von Ca2+ rückgefaltet wurde.Es wurde gleichermaßen über IMAC und anschließende SEC gereinigt.MbxA eluierte von der Superose 6-Erhöhungssäule früher (Elutionsvolumen 13,6 ml) und in einem breiteren Peak als das proMbxA-Dimer (Elutionsvolumen 14,9 ml), was auf eine Acylierung zurückzuführen ist und schließlich wahrscheinlich auf das Vorhandensein einer höheren oligomeren Spezies von MbxA hinweist einschließlich MbxA-Dimere und einer kleinen Fraktion von Monomeren (Elutionsvolumen 17,1 ml) (Abb. 4).Die CBB-Färbung bestätigte die Reinheit von proMbxA und aktiviertem MbxA bereits nach IMAC (Abb. 4b).MALS gekoppelt an SEC-Analyse der beiden proMbxA-Spezies, die über SEC getrennt wurden (blaue Linie, Peak 1 von Fig. 4, schwarze Linie, Peak 2 von Fig. 4).Das berechnete Molekulargewicht von 201,5 ± 1,1 kDa des ersten Peaks (blau) entspricht einem Dimer von proMbxA (theoretisches MW (6H-MbxA)2 = 201,2 kDa).Das Molekulargewicht von 93,9 ± 0,3 kDa des zweiten Peaks (schwarz) bestätigt eine monomere Spezies von proMbxA (theoretisches MW 6H-MbxA = 100,6 kDa).Neben HlyA ist von mehreren anderen porenbildenden RTX-Toxinen bekannt, dass sie eine posttranslationale Acylierung an zwei oder, wie im Beispiel von CyaA, mindestens einem konservierten internen Lysinrest erfordern, um toxische Aktivität zu verleihen20,61,62,63,64, 65.Für HlyA wurde gezeigt, dass die Acylierung beider Acylierungsstellen für die Toxizität erforderlich ist20.Die amidgebundene Fettacylierung wird durch eine Acyltransferase, die stromaufwärts des RTX-Gens kodiert wird, und ein Acyl-Trägerprotein erleichtert66.Das Vorhandensein des mbxC-Gens im M. bovis-Operon weist darauf hin, dass das exprimierte MbxA wahrscheinlich acyliert ist44.Die Lysinreste K536 und K660 von MbxA entsprechen den Acylierungsstellen bei K564 und K690 von HlyA (Abb. S1)20,44.Die Bereiche um die beiden Acylierungsstellen, die Reste H516–G566 und K640–Q680, teilen eine Sequenzidentität von etwa 46 % mit denen von HlyA.Diese Identität ist vergleichbar mit der Gesamtidentität beider Proteine.Um einen möglichen Acylierungsstatus von proMbxA, das in Abwesenheit von HlyC exprimiert wird, und MbxA, das mit HlyC coexprimiert wird, zu analysieren, verwendeten wir Massenspektrometrie.Für proMbxA wurde in Abwesenheit von HlyC keine Acylierung nachgewiesen.Im Gegensatz dazu wurden in Gegenwart von HlyC MbxA-Peptide, die acylierte Lysinreste enthielten, an den vorhergesagten Stellen K536 bzw. K660 identifiziert.In der acylierten MbxA-Variante wurde kein Peptid mit nicht acyliertem K536 oder K660 nachgewiesen.Myristoylierung (C14-Acylierung) sowie Hydroxymyristoylierung (C14-OH*) wurden für alle drei detektierten Peptide bestimmt, die die erste Acylierungsstelle K536 bedeckten (ERLTNGKYSYINK, LTNGKYSYINK und LTNGKYSYINKLK) (Abb. 6 und Tab. S1).Jedes dieser Peptide wurde durch mehr als ein vom Massenspektrometer aufgezeichnetes Fragmentspektrum identifiziert, was zu insgesamt 24 informativen Spektren für die C14-Modifikation mit zusätzlichen 5 informativen Spektren für die C14-OH*-Modifikationen dieser drei Peptide führte.Diese Peptidspektrumübereinstimmungen (PSM) können als halbquantitatives Maß für das Auftreten von Peptiden und Peptidmodifikationen verwendet werden.Das Peptid LTNGKYSYINK wurde zusätzlich mit C13-, C15- und C16-Acylierungen sowie einer C12-Hydroxyacylierung modifiziert gefunden.Diese Modifikationen mit C13-, C15-, C16- und C12-OH*-Fettsäuren sind wahrscheinlich weniger häufig, da sie nur mit 2, 4, 1 bzw. 1 PSM nachgewiesen wurden.Es wurde festgestellt, dass die zweite Acylierungsstelle, K660, nur in geringem Maße mit C14-Fettsäuren acyliert wird ( 6a ).Da keine anderen fettacylierten Lysinreste beobachtet wurden, schlussfolgern wir, dass die Modifikation von MbxA mit der nicht-nativen, aber promiskuitiven Acyltransferase HlyC, hier als Kreuzacylierung bezeichnet, nur auf die vorhergesagten Acylierungsstellen abzielt, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß (Tab S1). .MS-Analyse der MbxA-Acylierung (a) und HlyA-Acylierung (b).MbxA und HlyA wurden in vivo durch Co-Expression von HlyC67 acyliert.Für beide Acylierungsstellen in MbxA und HlyA, K536 und K660 bzw. K564 und K690, werden alle nachgewiesenen Acylmodifikationen im Bereich von C12- bis C16-Fettsäuren, einschließlich Hydroxyfettsäuren, mit der entsprechenden Anzahl von aufgezeichneten PSM angezeigt.Massenverschiebungen, die zu Hydroxyfettsäuren beitragen, könnten möglicherweise von der Oxidation von Tyrosinresten im Peptidfragment herrühren, und PSM von angenommenen Hydroxyacylierungen sind daher mit (*) gekennzeichnet.Für proMbxA und proHlyA, die beide in Abwesenheit von HlyC exprimiert wurden, wurden nur unmodifizierte Peptide nachgewiesen.Acylmodifikationen wurden nur in Peptiden nachgewiesen, die die vorhergesagten Lysinreste K536 und K660 von MbxA abdecken.Die PSM von C14-modifizierten Sequenzen legt nahe, dass die vorherrschende Modifikation Myristoylierung ist.Um zu testen, ob HlyC MbxA dieselben Modifikationen wie HlyA im E. coli BL21(DE3)-Hintergrund verleiht, wurden proHlyA (Fehlen von HlyC) und HlyA (Vorhandensein von HlyC) auf ihren Acylierungsstatus analysiert.Für HlyA konnten an beiden bekannten Acylierungsstellen20 acetylierte Peptide identifiziert werden (Tab S1).Bei K564 trugen mit C14-Acylierung und C14-OH*-Acylierung modifizierte Peptide beide mit 2 PSM bei.Die zweite Acylierungsstelle, K690, wurde vorwiegend mit C14-Fettsäuren acyliert (48 PSM), aber auch mit C14-OH*-Modifikationen hydroxyacyliert (8 PSM) gefunden.Darüber hinaus und im Gegensatz zur zweiten Acylierungsstelle von MbxA wurden auch weniger häufige Modifikationen, nämlich C12-, C13- und C16-Acylierungen, an der K690-Acylierungsstelle von HlyA mit 1, 2 bzw. 1 PSM nachgewiesen.Zusätzlich wurden unmodifizierte Peptide, die K564 und K690 enthielten, für HlyA nachgewiesen (5 bzw. 7 PSM) (Fig. 6b).Basierend auf den PSM-Daten gehen wir davon aus, dass die überwiegende Mehrheit der HlyA-Proteine ​​acyliert ist, da in proHlyA keine acylierten Peptide bestimmt wurden, sondern unmodifizierte Peptidvarianten einschließlich K564 und K690 mit 114 bzw. 68 PSM.Interessanterweise ist das Acylierungsverhältnis der beiden Stellen umgekehrt.Während in MbxA die erste Stelle effizienter acyliert wird, zeigte die zweite Stelle in HlyA eine effizientere Acylierung, obwohl die gleiche Acyltransferase die Reaktion im Zusammenhang mit dem Laborstamm BL21(DE3) katalysierte.Das Vorhandensein von Peptiden, die aus der Spaltung direkt nach der weniger häufig nachgewiesenen zweiten Acylierungsstelle von MbxA und der ersten Acylierungsstelle von HlyA resultieren, weist ferner darauf hin, dass diese Stellen nicht vollständig acyliert wurden, da eine Modifikation die Spaltungsstelle maskiert hätte (Tab. S1).Die Analyse der in vivo-Acylierung von HlyA durch HlyC bestätigt die Acylierung der K564- und K690-Acylierungsstellen.Ähnlich wie bei K536 in MbxA machen C14- und C14-OH*-Acylierungen den Großteil der PSM von Acyl-modifizierten Peptiden bei K690 in HlyA aus.Da acyliertes MbxA auf Schafblutagar hämolytische Aktivität zeigte, wurden menschliche Epithelzellen (HEp-2) und menschliche T-Lymphozyten (Jurkat) mit einem Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassay auf ihre Empfindlichkeit gegenüber MbxA getestet68.Beide Zelllinien waren anfällig für eine MbxA-induzierte LDH-Freisetzung, was eine Schädigung der Zellmembran impliziert, und zeigten eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve mit steigenden MbxA-Konzentrationen (Abb. 7).Dies ist in der Tat ein neuer Befund, da bisher nur von Rinderzellen berichtet wurde, dass sie von MbxA angegriffen werden.Die halbmaximale Wirkung (zytotoxische Dosis 50, CD50) von MbxA gegen HEp-2-Zellen trat bei einer Konzentration von 28,1 ± 4,7 nM auf.Für Jurkat-Zellen wurde eine Zytotoxizität von 50 % bei einer niedrigeren Konzentration von MbxA erreicht, was zu einem CD50-Wert von 17,7 ± 3,9 nM führte.Wichtig ist, dass proMbxA nach 1 h keine zytotoxische Wirkung zeigte.Die Berechnung der CD50-Werte wurde unter der Annahme durchgeführt, dass der gesamte Pool von MbxA aktiv ist.Daher entsprechen die angegebenen Werte wahrscheinlich einer Obergrenze für die CD50-Werte.Diese Daten zeigen, dass MbxA in einem ähnlichen Konzentrationsbereich sowohl für menschliche Epithel- als auch für Immunzellen toxisch ist, aber unbedingt eine Aktivierung durch Acylierung erfordert, um eine membranschädigende Aktivität zu verleihen.MbxA induziert die LDH-Freisetzung in menschlichen Epithelzellen (HEp-2, blau gefüllter Kreis) bzw. menschlichen T-Zellen (Jurkat, rot gefülltes Quadrat).Die durch MbxA-induzierte Membranschädigung vermittelte Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines LDH-Freisetzungsassays gemessen.Die LDH-Freisetzung in den Überstand wurde nach 1 h Inkubation mit MbxA gemessen.Für die CD50-Bestimmung wurde die MbxA-Zytotoxizität gegen die MbxA-Konzentration aufgetragen und mit GraphPad Prism 7 nach Gl.(2) (siehe Materialien und Methoden).Für jeden Zelltyp wurde die höchste LDH-Freisetzung auf 100 % gesetzt.Messungen mit proMbxA wurden der Einfachheit halber nicht aufgenommen, da selbst bei Konzentrationen von 1 µM keine LDH-Freisetzung nachgewiesen wurde.Da proMbxA keine Zytotoxizität gegenüber Epithelzellen oder T-Zellen zeigte, haben wir weiter untersucht, ob proMbxA potenzielle MbxA-Bindungsstellen schützen kann, indem es die Erkennungsstelle auf der Oberfläche menschlicher Zellen bindet und abschirmt.Um dies zu testen, behandelten wir Zellen mit 250 nM proMbxA, einer Konzentration, die maximale Wirkungen erzielt, wenn aktives MbxA verwendet wird.Falls proMbxA in der Lage ist, spezifische Strukturen zu erkennen und zu binden, sollte diese Vorbehandlung die Zellen vor aktivem MbxA schützen, das in einem zweiten Schritt aufgebracht wurde.Basierend auf einem zuvor etablierten Protokoll69 hatte eine Vorinkubation mit 250 nM proMbxA für 30 min bei 37 °C vor der Zugabe einer Reihenverdünnung von aktivem MbxA zu HEp-2-Zellen und Jurkat-Zellen keine Auswirkung auf die Dosis-Wirkungs-Kurve und den CD50-Wert im Vergleich zu MbxA allein (Abb. 8).Das Vorhandensein von proMbxA verringerte die Empfindlichkeit keiner der beiden Zelllinien, was darauf hindeutet, dass proMbxA die zytotoxische Wirkung von MbxA nicht beeinträchtigen kann.proMbxA schützt Epithelzellen (HEp-2) nicht vor MbxA-induzierter Membranschädigung.Die Vorinkubation mit 250 nM proMbxA für 30 min bei 37 °C führte zu einer nahezu identischen Dosis-Wirkungs-Kurve zu MbxA (schwarz) im Vergleich zur Behandlung mit MbxA allein (37 °C für 30 min, blau).proMbxA war nicht zytotoxisch (orange).Ein ähnlicher Effekt wurde für Jurkat-Zellen beobachtet.Die Vorinkubation mit 250 nM proMbxA für 30 min bei 37 °C führte zu einer nicht signifikant unterschiedlichen Dosis-Wirkungs-Kurve für MbxA (hellgrün) im Vergleich zur Behandlung mit MbxA allein (37 °C für 30 min, grün).Die durch MbxA-induzierte Membranschädigung vermittelte Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines LDH-Freisetzungsassays gemessen.Die LDH-Freisetzung in den Überstand wurde nach 1 h Inkubation mit MbxA gemessen.Die relative LDH-Freisetzung wurde aus der bei jeder Messung maximal erreichten LDH-Freisetzung berechnet, die auf 100 % gesetzt wurde.Für die CD50-Bestimmung wurde die MbxA-Zytotoxizität gegen die MbxA-Konzentration aufgetragen und mit GraphPad Prism 7 nach Gl.(2) (siehe Material und Methoden).Um die Dynamik und das Erscheinungsbild der Veränderungen in der Membranmorphologie von HEp-2-Zellen, die bei der Inkubation mit MbxA auftraten, genauer zu untersuchen, verwendeten wir konfokale Bildgebung lebender Zellen.Daher wurde die Plasmamembran von HEp-2-Zellen vor der Inkubation mit MbxA mit CellMask Deep Red gefärbt.Parallel dazu wurde der membranundurchlässige hochaffine DNA-Farbstoff Sytox Green in das umgebende Medium der HEp-2-Zellen eingebracht, um die Permeabilisierung der HEp-2-Zellen zu überwachen, die durch ein zunehmendes Sytox Green-Signal angezeigt wird.Verschiedene Endkonzentrationen von MbxA (250 nM, 30 nM und 10 nM) und 250 nM proMbxA wurden den HEp-2-Zellen zugeführt, und konfokale Mikroaufnahmen wurden alle 15 s für insgesamt 20 min aufgenommen.Wenn HEp-2-Zellen mit 250 nM MbxA behandelt wurden (Abb. 9), trat Sytox Green innerhalb der ersten Minuten schnell in die Zellkerne ein und färbte die DNA mit zunehmender Intensität während des Beobachtungszeitraums von 20 Minuten.Eine sofortige Veränderung der Plasmamembranmorphologie konnte als Deformation und Blasenbildung an den Zellgrenzen (zweite Reihe) beobachtet werden, und das markante Auftreten großer Membranblasen wurde über der HEp-2-Zellschicht (dritte Reihe) gesehen.Um die dosisabhängige Wirkung von MbxA in Experimenten mit lebenden Zellen weiter zu verifizieren und zu beobachten, wurde der Zufluss von Sytox Green analysiert, als HEp-2-Zellen mit 30 nM MbxA (einer Konzentration um die CD50, bestimmt durch den LDH-Freisetzungsassay) und 10 provoziert wurden nM (eine Konzentration, die zu minimalen Effekten führte; Abb. 7).Konfokale Mikroskopiebilder von MbxA-induzierter Membranpermeabilisierung und Membranbläschen in HEp-2-Zellen.HEp-2-Zellen wurden mit MbxA (250 nM, 30 nM und 10 nM bei 37 °C) oder proMbxA (250 nM) inkubiert und zum Zeitpunkt Null (erste Reihe) und nach 20 min (zweite Reihe) analysiert.Die Plasmamembran wurde mit CellMask Deep Red gefärbt und die Membranpermeabilisierung wurde mit Sytox Green-Färbung der Kern-DNA überwacht.Die Inkubation von HEp-2-Zellen mit 250 nM, 30 nM und 10 nM MbxA führte zu einer DNA-Färbung mit Sytox Green-Zellen in abnehmender Intensität entsprechend der abnehmenden Konzentration von MbxA und damit zu einer Membranpermeabilisierung.DNA-Färbung wurde nicht beobachtet, wenn HEp-2-Zellen mit 250 nM proMbxA inkubiert wurden.Membranbläschen wurden in derselben Fokusschicht wie die HEp-2-Zellen (zweite Reihe; weiße Pfeile) und über den HEp-2-Zellen (dritte Reihe; weiße Pfeile) beobachtet.Während die Inkubation mit 250 nM und 30 nM MbxA zu einem starken Auftreten von Membranbläschen führte, war die Inkubation mit 10 nM MbxA weniger auffällig und die Inkubation mit 250 nM proMbxA führte zu keiner Bildung von Bläschen.Siehe Abb. S4 für die gesamten Bilder.Maßstabsleiste: 20 µm.Um die Korrelation zwischen Membranpermeabilisierung und Zelltod unter Verwendung verschiedener MbxA-Konzentrationen zu verstehen, wurde eine Quantifizierung des Sytox Green-Signals pro Zellkern über die Zeit durchgeführt (Abb. 10).Die Inkubation von HEp-2-Zellen mit 30 nM MbxA führte ebenfalls zu einer nachweisbaren Sytox Green-Färbung der DNA, aber die Steigung der Intensität pro Zellkern über die Zeit war deutlich geringer im Vergleich zu der mit 250 nM MbxA beobachteten Sytox Green-Färbung (Abb. 9 und 9). 10).Darüber hinaus erfolgte die Membranblasenbildung von HEp-2-Zellen mit 30 nM MbxA langsamer und die Bildung von Blasen war weniger ausgeprägt als bei 250 nM MbxA.Bei Verwendung von nur 10 nM MbxA während der Messung wurde sogar noch weniger oder gelegentlich keine Sytox Green-Intensität pro Kern festgestellt, und einige Membranbläschen wurden an den Zellen und über der Zellschicht beobachtet (Abb. 9 und Abb. S4).Nat.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarEng.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarEUR.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarMed.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarAuflösungArtikel CAS PubMedGoogle ScholarAuflösungAuflösungAuflösungAuflösungArtikel CAS PubMedGoogle ScholarAuflösungArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarEUR.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarPhys.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarEntwicklerbiol.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel ADS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMed.Appl.Umgebung.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen